Science︱赵祥等揭示逆锁键工程可以调节T细胞受体的信号强度且不引入脱靶毒性，有望应用于TCR-T肿瘤免疫细胞治疗

撰文︱Anton

责编︱王思珍 

T细胞受体（T cell receptor，TCR）是开启T细胞分化与功能的关键开关蛋白质，其识别的配体为短肽-主要组织相容性复合物（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）。其中短肽多为数十个氨基酸组成的短链蛋白分子，其来源为肿瘤细胞、病原微生物和自身被降解的蛋白质等。pMHC作为一类抗原大分子，TCR对pMHC的特异性结合与识别是T细胞发挥适应性免疫的重要分子基础。TCR已被广泛应用于过继性细胞免疫治疗，用于转导癌症病人的T细胞，并发挥杀伤肿瘤细胞的生理功能。然后能够高效识别肿瘤抗原pMHC的TCR在人体内较为罕见，为此人们需要在体外对TCR进行工程改造和定性进化，以此提高TCR突变体的信号强度。一般认为TCR识别pMHC后的信号强度与TCR结合pMHC的亲和力有关，所以常采用亲和力成熟（affinity maturation）的方法改造TCR。然而，高亲和力的TCR很有可能失去识别pMHC的特异性，在临床试验中可能导致脱靶毒性（off-target toxicity）并攻击健康组织，导致病人死亡[1]。因此，如何不依赖于亲和力成熟、提高TCR的信号强度、消除TCR工程改造后可能产生的脱靶毒性，是深入理解TCR信号启动的分子机制和应用TCR于肿瘤免疫治疗亟需解决的问题。

2022年4月8日，斯坦福大学赵祥博士、K. Christopher Garcia教授等人在Science上发表了题为“Tuning T cell receptor sensitivity through catch bond engineering”的研究。该研究发现TCR信号强度与逆锁键（catch bond）的键寿命峰值（peak bond lifetime）呈正相关，并且可以通过在T细胞上表达TCR文库进行功能选择来筛选高信号强度、低亲和力的TCR突变体，这些TCR突变体均形成了新的逆锁键。逆锁键工程改造后的肿瘤特异性TCR不仅可以高效杀伤肿瘤细胞，并且完全消除了潜在的脱靶毒性。

逆锁键（catch bond）是一种生物力导致的非共价分子间相互作用，其特征是“反直觉”的，即在pN量级的剪切拉力的作用下，蛋白质分子之间相互作用的键寿命（bond lifetime）随着施加生物力的增加而延长。蛋白质分子之间不仅没有解离，相反因为逆锁键的存在被锁定在束缚的状态。与逆锁键相对应的相互作用是滑移键（slip bond），即在某些量值的生物力作用下，蛋白质分子之间相互作用的键寿命随着剪切拉力的增加而缩短。逆锁键和滑移键共同组成一对分子开关，决定着许多种配体-受体之间的相互作用，具有重要的生理意义。例如大肠杆菌对于尿路的黏附、白细胞对于血管壁的黏附、Notch受体的激活、TCR的激活、肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用与微丝解聚等。研究者过去发现，一种HIV来源的抗原短肽，与B35 MHC形成pMHC复合物后，可以以类似的亲和力结合两种不同的TCR：TCR55和TCR589。TCR589可以被B35-HIV pMHC正常激活，然而TCR55无法被激活[2]，说明亲和力并不是决定TCR信号强度的唯一因素。生物膜力学探针（biomembrane force probe，BFP）实验发现B35-HIV与TCR589形成逆锁键，但与TCR55仅形成滑移键。这暗示逆锁键的形成对于TCR信号的开启是必需的，并且可能可以通过逆锁键的形成与转化，在保持亲和力在类似水平的情况下，获得高信号强度的TCR突变体。

作者首先假设可以通过突变TCR的互补决定区（complementarity determining regions，CDRs）的一些残基为极性或者带电荷的氨基酸，从而在TCR-pMHC的相互作用中形成新的逆锁键。在选择TCR残基进行建库时，需要有TCR-pMHC的晶体结构信息，并且只选取距离pMHC至少0.4纳米的残基，从而防止富集亲和力成熟的TCR突变体。TCR文库经合成后被制备成慢病毒文库，并转导入T细胞系，从而实现在T细胞表面展示TCR文库。T细胞文库经抗原刺激后，作者采用CD69抗体染色来标记TCR被激活后的信号强度、pMHC四聚体染色来标记TCR突变体结合pMHC的亲和力高低。接着，作者对T细胞文库进行分选，作者将目标区域定位为高水平的CD69荧光信号和低水平的pMHC四聚体荧光信号，从而富集高TCR信号强度、低结合pMHC亲和力的TCR突变体，而这些突变体可能是通过富集逆锁键获得这一表型的。

图1 TCR逆锁键工程改造的实验流程

（图源：Zhao X, et al., Science, 2022）

作者首先选取TCR55作为原理验证实验的研究对象，设计了TCR55的突变体文库，并进行了功能筛选（functional selection）。作者发现了两个符合实验假设的突变体：一个突变体仅有TCR55a链第98位残基丙氨酸突变成组氨酸这一个突变，另一个突变体仅有TCR55b链第50位残基丙氨酸突变成天冬氨酸这一个突变。这两个单氨基酸突变体均可以被相同的抗原pMHC B35-HIV激活，并且结合B35-HIV的亲和力保持在突变前的水平。BFP实验证明这两个突变体均将滑移键转化成了逆锁键。另外，作者还发现这两个残基位点还可以允许其他多种极性或带电荷氨基酸的突变将滑移键转化成逆锁键，于是作者提出了“逆锁键工程的热点残基”的概念。进一步研究发现数十种不同的TCR55突变体的信号强度和结合pMHC的亲和力不相关，但是与逆锁键形成过程中的键寿命峰值呈正相关，说明可以通过调节逆锁键的键寿命峰值来精准调控TCR的激活水平。另外，作者通过一种Jurkat T细胞信号通路报告系统证明逆锁键工程改造后的TCR可以正常激活多个下游信号通路如NFAT、ERK和p38。作者还通过一种“智慧珠子”平台技术BATTLES（Biomechanically-Assisted T-cell Triggering for Large-scale Exogenous-pMHC Screening）将符合生理条件的低浓度水平的pMHC B35-HIV镀在智慧珠子上，智慧珠子通过在不同温度下改变尺寸来对黏附在珠子上的T细胞施加外力，从而模拟逆锁键的形成并激活T细胞，实验结果证明逆锁键工程改造后的TCR仍可以被生理条件下的低浓度pMHC激活，暗示逆锁键工程改造后的TCR在体内可以正常工作。

为了验证逆锁键工程技术是否可以应用于肿瘤抗原特异的TCR，从而获得高信号强度、低亲和力、无脱靶毒性的TCR突变体，作者选取了一个著名的TCR-T细胞免疫治疗的失败案例：黑色素瘤抗原MAGE-A3的特异性野生型TCR经过亲和力成熟改造后，获得了一个亲和力提高数百倍的TCR- A3A。A3A在临床试验中导致了两位病人的死亡。后续研究发现病人心脏中出现大量T细胞的浸润和损伤。原来A3A产生了脱靶毒性，A3A不仅可以高效识别黑色素瘤抗原MAGE-A3，还可以结合心脏表达的抗原TITIN[1,3]。作者基于野生型的TCR设计了文库并进行了逆锁键工程的功能筛选，获得了多达13种不同的符合表型预期的TCR突变体。这些TCR突变体不仅可以被肿瘤抗原高水平激活，还可以对潜在的脱靶蛋白TITIN保持激活沉默。从机理上来看，这些TCR突变体结合肿瘤抗原的亲和力比A3A低了10-50倍，保持在了低亲和力水平，并且完全丧失结合TITIN的亲和力；作者选取了其中两种TCR突变体（94a-14和20a-18）做进一步研究，发现这些突变体均能与肿瘤抗原形成逆锁键，但与TITIN仅形成滑移键，说明脱靶毒性被移除的另一个机理是逆锁键/滑移键的转化。这两种TCR突变体的激活强度仍由逆锁键的键寿命峰值直接决定，并且在原代T细胞中表现出了和A3A相媲美的肿瘤杀伤能力。为了回答逆锁键工程改造是否会引入其他未知的脱靶毒性，作者通过酵母展示技术构建了peptide-HLA-A1文库，筛选可以结合TCR突变体的短肽，并预测哪些野生型蛋白质可能可以激活这些TCR突变体。筛选结果显示对于亲和力成熟的A3A，肿瘤抗原MAGE-A3和脱靶毒性蛋白TITIN均被高顺位预测为A3A的激活抗原，另外作者还发现了MAGE-A6、FAT2两种新的A3A的脱靶毒性蛋白。然而对于逆锁键工程改造的TCR突变体，只有肿瘤抗原MAGE-A3被高顺位预测为激活抗原，TITIN并不在激活抗原的预测清单上，并且预测清单上的其他抗原均无法激活逆锁键工程改造的TCR突变体。

图2 逆锁键工程改造后的TCR可以激发更强的TCR信号

（图源：Zhao X, et al., Science, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者通过深入研究TCR激活的分子机理，进一步明确了逆锁键的形成对于TCR激活的重要性，并且首次提出TCR激活的信号强度与逆锁键的键寿命峰值呈正相关这一新学说，这是对过去亲和力学说的有力补充。基于此基础研究的发现，作者证明逆锁键是可以被工程化改造的生物物理指标，发明了逆锁键工程改造TCR的基本流程，通过合理的筛选标准，可以获得逆锁键富集的TCR突变体，并且这些突变体获得了TCR激活强度提高、结合pMHC的亲和力保持在低水平、无脱靶毒性的特征。但是逆锁键工程改造后的TCR在体内杀伤实体瘤的效果如何有待进一步研究；另外具体实践中研究者往往并不具有TCR-pMHC的晶体结构信息，如何不依赖晶体结构而仅依赖TCR的基因序列就可以设计合理的TCR文库并完善现在的逆锁键工程的操作流程，仍需进一步研究。逆锁键工程的方法可能可以彻底改变目前的游戏规则，颠覆亲和力成熟的传统方法，并被广泛用于肿瘤特异的TCR工程化改造和TCR-T细胞肿瘤免疫治疗中。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl5282

第一作者赵祥博士（左），通讯作者K. Christopher Garcia教授（右）

（照片提供自K. Christopher Garcia实验室）

斯坦福大学的赵祥博士为该研究论文的第一作者，K. Christopher Garcia教授为通讯作者。犹他大学的Brian Evavold教授、Elizabeth Kolawole博士，NIH的Ronald Germain教授、Waipan Chan博士，斯坦福大学的Polly Fordyce教授、冯寅年博士、杨鑫博博士等做出了重要贡献。本研究获得了NIH、HHMI、Parker Foundation for Cancer Immunotherapy、Mathers Foundation、Stanford Bio-X Seed Grant等机构的基金支持。

K. Christopher Garcia教授长期致力于细胞因子、T细胞受体、GPCR、Wnt信号通路等的结构生物学和蛋白质工程方面的研究，实验室以免疫学领域相关的受体-配体为主要研究对象，并积极推动相关研究成果进入临床试验与研究。

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制版︱王思珍

本文完